夹心Ct实时定量PCR(SC-PCR)技术用于高效筛选单拷贝T-DNA转基因植株

农杆菌介导的遗传转化是植物转基因的主要手段。然而，农杆菌介导的转基因往往伴随着多拷贝T-DNA插入和载体骨架序列的整合，这将导致转基因表达不稳定，使基因功能分析复杂化。因此，高效鉴定单拷贝T-DNA无骨架序列的转基因植株是作物转基因育种以及植物基因功能分析的重要目标。除了耗时、操作繁琐的Southern杂交外，目前没有更多被广泛接受的方法用于鉴定单拷贝T-DNA植株。

近期，华南农业大学胡宇飞副教授课题组在Plant Science在线发表题为“Sandwich Ct real-time PCR identifies single-copy T-DNA integration accumulating in backbone-free transgenic T1 Arabidopsis”的研究论文。该研究开发了一种夹心Ct实时定量PCR方法（Sandwich Ct real-time PCR，简称SC-PCR），可以高效筛选单拷贝转基因植株。SC-PCR基于实时定量PCR技术开发，但不需要计算ΔCt，ΔΔCt以及2-ΔΔC。通过直接比较T-DNA序列和两对参考序列扩增Ct值的相对关系，判断拷贝数的变化，避免了Ct值多步计算所带来的误差。以标准双拷贝植株seb19或标准质粒pGHN-R为模板，T-DNA的Ct值介于R1和R2间，形成R1-T-R2的夹心Ct关系；单拷贝T-DNA的Ct值相对双拷贝T-DNA增加约1，从而产生R1-R2-T的Ct模式（图1）